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高效液相色譜儀分析中常用的定性方法有利用已知標準樣品定性、利用檢測器的選擇性定性和利用紫外檢測器全波長掃描功能定性等。
一、利用已知標準樣品定性：
利用標準樣品對未知化合物定性是較常用的高效液相色譜定性方法。
由于每一種化合物在特定的色譜條件下（流動相組成、色譜柱和柱溫等相同），其保留值具有特征性，因此，可以利用保留值進行定性。如果在相同的色譜條件下，被測化合物與標準樣品的保留值一致，可以初步認為被測化合物與標準樣品相同。若流動相組成經多次改變后，被測化合物的保留值仍與標準樣品的保留值一致，就能進一步證實被測化合物與標準樣品為同一化合物。
二、利用檢測器的選擇性定性：
同一種檢測器對不同種類的化合物的響應值是不同的，而不同的檢測器對同一種化合物的響應也是不同的。所以當某一被測化合物同被兩種或兩種以上檢測器檢測時，兩檢測器或幾個檢測器對被測化合物檢測靈敏度比值與被測化合物的性質是密切相關的，可以用來對被測化合物進行定性。這是雙檢測器定性的基本原理。
雙檢測器體系的聯接有串聯聯接和并聯聯接方式。當兩種檢測器中的一種是非破壞型的，可以采用簡單的串聯聯接方式，方法是將非破壞型檢測器串接在破壞型檢測器之前。若兩種檢測器都是破壞型的，需采用并聯方式聯接，方法是在色譜柱的出口端連接一個三通，分別聯接到兩個檢測器上。在高效液相色譜中常用于定性分析的雙檢測體系是紫外檢測器（UVD）和熒光檢測器（FLD）。
三、利用紫外檢測器全波長掃描功能定性：
紫外檢測器是高效液相色譜中使用廣泛的一種檢測器。全波長掃描紫外檢測器可以根據被檢測化合物的紫外光譜圖提供一些有價值的定性信息。傳統的方法是在色譜圖上某組分的色譜峰出現極大值，即濃度最大時，通過停泵等手段，使組分在檢測池中滯留，然后對檢測池中的組分進行全波長掃描，得到該組分的紫外可見光譜圖，再取可能的標準樣品按同樣方法處理。對比兩者光譜圖即能鑒別出該組分與標準樣品是否相同。某些有特殊紫外光譜圖的化合物也可以通過對照標準譜圖來識別。
此外，利用二極管陣列檢測器得到的色譜信號、時間和波長的三維譜圖進行定性，比傳統方法優勢更大。
